In uno studio pubblicato su Nature Communications, ricercatori coreani hanno condotto interessanti test preclinici su un innovativo approccio di editing genomico
“Quale creatura cammina su quattro zampe al mattino, su due a mezzogiorno e su tre alla sera?” Nella mitologia, i viandanti diretti a Tebe che non sapevano fornire una risposta corretta venivano divorati dalla Sfinge; oggi quasi tutti conoscono la risposta al più celebre enigma della letteratura che descrive perfettamente le età dell’uomo. L’invecchiamento è un processo naturale al centro di numerosi studi scientifici sulla disattivazione di geni responsabili o sul contrasto a proteine chiave nella sua progressione; è oggetto di ricerche da parte di multinazionali farmaceutiche e cosmetiche, e rappresenta il processo fisiologico che da sempre ci sforziamo di arrestare.
Può anche costituire il tratto distintivo di una rara condizione genetica, la progeria, associata ad elevata mortalità, per la quale non esistono attualmente cure. Ma il futuro potrebbe riservare sorprese grazie alle tecniche di editing del genoma.
In un articolo da poco comparso su Nature Communications un gruppo di studiosi coreani ha descritto una possibile strategia di correzione dell’anomalia genetica alla base della malattia, non focalizzata sulla mutazione patologica - come ci si aspetterebbe - ma su un passaggio chiave di trasformazione della proteina mutata, al termine del quale essa assume una connotazione patologica. Per capire di cosa si tratta occorre analizzare il contesto della progeria.
LA SINDROME DI HUTCHINSON-GILFORD
La sindrome di Hutchinson-Gilford (HGPS), anche nota come progeria, è una malattia genetica provocata, in oltre il 90% dei casi, da mutazioni del gene LMNA: la variante più frequente (c.1824C>T; p.G608G) attiva un sito di splicing criptico sull'esone 11, determinando la produzione di una forma tronca della proteina lamina A, denominata progerina.
Il volto più celebre della progeria è quello di Sammy Basso, biologo e fondatore dell’Associazione Italiana Progeria Sammy Basso onlus (AIProSaB), scomparso due anni fa proprio per le conseguenze della sua malattia, appartenente al gruppo delle laminopatie - dal nome della proteina interessata dalle mutazioni che causano la progeria. Infatti, la lamina A ha una funzione strutturale fondamentale per il nucleo della cellula, partecipando alla creazione di un reticolo di proteine indispensabile per preservare la forma del nucleo, organizzare la cromatina e contribuire così alla stabilità del DNA.
Attualmente, l’unica terapia farmacologica approvata per la HGPS è lonafarnib, un inibitore della farnesil-transferasi che prolunga la sopravvivenza mediana di circa 2,5 anni. Tuttavia, il farmaco non agisce esclusivamente sulla progerina ma interferisce con la modificazione di altre proteine cellulari essenziali e di ulteriori lamine nucleari, suscitando potenziali effetti avversi a livello sistemico.
Nel corso degli anni sono state messe a punto anche strategie sperimentali, fra cui l’impiego di rapamicina per favorire la degradazione della progerina e, soprattutto, le tecniche di editing del genoma per correggere la mutazione responsabile della malattia. Queste ultime, tuttavia, sono specifiche per singole varianti del gene LMNA e non sono esenti da rischi di alterazioni genomiche indesiderate.
IL RUOLO DELLA FARNESILAZIONE
In condizioni normali, tra i processi a cui è soggetto il precursore della lamina A durante l’iter di maturazione che conduce alla forma attiva della proteina c’è la farnesilazione, che prevede una serie di modifiche dell’estremità C-terminale. Invece, la progerina è caratterizzata da un’alterazione che impedisce l’azione di una metalloproteasi (ZMPSTE24) e perciò tende ad accumularsi nella forma “farnesilata”, causando deformazioni dell’involucro nucleare, modifiche dell’organizzazione della cromatina e instabilità genomica. Tali anomalie si ripercuotono sui muscoli, sulle ossa e sul sistema cardiovascolare, suscitando la sintomatologia tipica della progeria.
Perciò lo studio dei ricercatori coreani propone una strategia alternativa - denominata Farnesylation Amino-acid Targeted Editing (FATE) - messa a punto con l’obiettivo di modificare direttamente il sito di farnesilazione della proteina, anziché correggere la mutazione patologica originaria. In pratica il bersaglio è a valle della mutazione e ciò lo rende ancora più interessante, dal momento che il possibile trattamento potrebbe risultare applicabile a diverse varianti genetiche responsabili di produrre proteine patologiche cosiddette “farnesilate”. Perciò, lo scopo della ricerca pubblicata su Nature Communications è stato triplice: caratterizzare i percorsi molecolari responsabili della vulnerabilità muscolare nella HGPS, verificare se l’interruzione della farnesilazione fosse in grado di ripristinare l’organizzazione nucleare e la riparazione del DNA e, infine, valutare la fattibilità della somministrazione del correttore mediante RNA messaggero all’interno di nanoparticelle lipidiche.
Per cominciare, i ricercatori hanno fatto uso di modelli cellulari avanzati - gli organoidi - ottenuti da cellule staminali pluripotenti umane per mettere a confronto diverse varianti del gene LMNA e valutare la risposta di tessuti differenti in condizioni genetiche controllate: attraverso tecniche di biologia molecolare essi hanno approfondito l’espressione genica, la localizzazione delle proteine, l’integrità della cromatina e valutato gli eventuali effetti “off-target” del processo di editing. Così hanno capito che l’accumulo di progerina avviene in prevalenza nel compartimento muscolare, mentre quello neuronale risulta relativamente preservato. Inoltre, la percentuale di cellule muscolari positive alla progerina risultava aumentata durante la maturazione degli organoidi.
FATE: UN METODO INNOVATIVO DI UTILIZO DELL’EDITING DEL GENOMA
Per introdurre nel gene LMNA la variante (una sostituzione c.1981T>C) corrispondente alla mutazione aminoacidica p.C661R, la strategia messa a punto dai ricercatori coreani, denominata FATE, utilizza un sistema di base editing che produce una modifica capace di compromettere il riconoscimento del sito da parte della farnesil-transferasi. In questo modo, la progerina continua a essere prodotta ma perde la capacità di ancorarsi alla membrana nucleare e generare il disordine cellulare all’origine della malattia; negli organoidi trattati, l’introduzione della modifica ha eliminato l’accumulo della progerina intorno al nucleo. Tale cambiamento si è associato al ripristino della funzionalità di proteine coinvolte nella riparazione delle rotture a doppio filamento del DNA.
Le analisi trascrittomiche hanno evidenziato che il profilo molecolare del compartimento muscolare degli organoidi trattati era simile a quello dei controlli geneticamente sani. Sono risultate attenuate le firme geniche associate alla miopatia e ripristinate quelle relative alla riparazione del DNA. Un aspetto rilevante è che la strategia ha mostrato effetti anche in un modello di HGPS atipica, in cui FATE ha migliorato la localizzazione della proteina 53BP1 (coinvolta in processi di riparazione del DNA), sostenendo un’opportunità di applicazione che va oltre la mutazione classica.
SOMMINISTRAZIONE MEDIANTE RNA MESSAGGERO
Per valutare una possibile modalità di somministrazione, gli autori dello studio hanno utilizzato un RNA messaggero, codificante per il sistema di editing, incapsulato all’interno di nanoparticelle lipidiche (LNP). Il trattamento mediante microiniezione nel compartimento muscolare degli organoidi ha consentito di raggiungere un’efficienza di editing massima dell’8,55% che, sebbene inferiore al limite del 10%, ha prodotto effetti fenotipici evidenti nelle cellule trattate, comprendenti la riduzione dell’accumulo della progerina e il ripristino di marcatori della risposta al danno del DNA. Il risultato indica che anche un editing parziale può produrre benefici cellulari misurabili, almeno nel modello sperimentale utilizzato.
Sebbene i risultati siano promettenti, lo studio presenta ancora limiti importanti: gli esperimenti sono stati condotti principalmente su organoidi e cellule in coltura, non ancora su modelli animali o pazienti; inoltre, l’efficienza di editing ottenuta è relativamente bassa e sarà necessario migliorare la distribuzione del trattamento nei tessuti bersaglio. Occorre inoltre verificare gli effetti a lungo termine della produzione di progerina non farnesilata: la perdita della farnesilazione non garantisce, infatti, che la proteina diventi completamente innocua.
Saranno perciò necessari studi in vivo per valutare la sicurezza dell’approccio, la durata dell’effetto terapeutico, la possibilità di somministrazioni ripetute e l’efficacia nei tessuti cardiovascolari, particolarmente coinvolti nella sindrome di Hutchinson-Gilford. Tuttavia, lo studio coreano dimostra che la farnesilazione della progerina può essere un bersaglio molecolare efficace per contrastare alcuni importanti aspetti nella patogenesi della malattia.
